Bewurke troch Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, Kalifornje, goedkard op 25 desimber 2020 (besjoen op 25 oktober 2020)
Wy rapportearje de ynteraksje tusken subunits yn 'e replikaasje fan coronaviruses-transkripsjekompleksen, dy't essensjeel binne foar replikaasje en evolúsjonêr behâld.Wy levere bewiis dat it NiRAN-domein assosjearre mei nsp12 nukleoside monofosfaat (NMP) transferase-aktiviteit hat yn trans, en identifisearre nsp9 (in RNA-binend proteïne) as har doel.NiRAN katalysearret de kovalente befestiging fan 'e NMP-groep oan' e bewarre nsp9-amino-terminus yn in reaksje dy't fertrout op Mn2+-ionen en neistlizzende bewarre Asn-residuen.It waard fûn dat NiRAN-aktiviteit en nsp9 NMPylaasje essensjeel binne foar replikaasje fan coronavirus.De gegevens kinne ús te keppeljen dizze aktiviteit fan de nested firus enzyme marker oan de foarige observaasjes yn de hypoteze dat de inisjatyf fan RNA synteze yn in klasse fan RNA firussen is funksjoneel en evolúsjonêr konsekwint.
De RNA-ôfhinklike RNA-polymerase (RdRps) fan Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, en 12 oare famyljes) is keppele oan it amino-terminale (N-terminale) domein yn it net-strukturele proteïne (nsp) frijjûn út it polyprotein, neamd NiRAN 1ab is gearstald út virale haadprotease (Mpro).Earder waard it arteriële firus NiRAN-RdRp nsp's eigen GMPylaasje / UMPylaasjeaktiviteit rapportearre, en it waard suggerearre om in transient te generearjen foar de oerdracht fan nukleoside monofosfaat (NMP) nei it (op it stuit ûnbekende) firus en / of selbiopolymerisaasje Dingen.Hjir litte wy sjen dat it coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E en Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+-ôfhinklike NMPylaasjeaktiviteit hat, dy't ôflaat is fan nsp9 troch de formaasje fan Mpro-mediated nsp9. de N-terminale flankearjende nsps wurdt proteolytysk frijlitten, de phosphoramidate is bûn oan it primêre amine (N3825) oan 'e N-terminal fan nsp9.Uridinetrifosfaat is it foarkommende nukleotide yn dizze reaksje, mar adenosinetrifosfaat, guanosinetrifosfaat en cytidinetrifosfaat binne ek gaadlike ko-substraten.Mutaasjestúdzjes mei rekombinante coronavirus nsp9- en nsp12-proteinen en genetysk manipulearre HCoV-229E-mutanten bepale de residuen nedich foar NiRAN-bemiddele nsp9 NMPylaasje en firusreplikaasje yn selkultuer.De gegevens befêstige de foarsizzing fan NiRAN aktive side-residuen en bepale de wichtige rol fan nsp9 N3826-residuen yn nsp9 NMPylaasje en firusreplikaasje in vitro.Dit residu is diel fan 'e bewarre N-terminale NNE-tripeptide-sekwinsje en die bliken it ienige ûnferoarlike residu fan nsp9 en syn homologen yn' e famylje fan coronavirus te wêzen.Dizze stúdzje leveret in solide basis foar de funksjonele stúdzje fan NMPylaasjeaktiviteit fan oare nestelde firussen en stelt mooglike doelen foar foar de ûntwikkeling fan antivirale medisinen.
Nidovirales posityf-stranded RNA-firus ynfektearret in ferskaat oan vertebraten en ynvertebraten (1, 2).De oarder omfettet op it stuit 14 famyljes (3), wêrfan de famylje Coronavirus yn 'e ôfrûne 20 jier wiidweidich ûndersocht is.Op dat stuit ûntstienen trije soönoatyske coronaviruses út bistegastheren en soarge foar grutskalige útbraken fan slimme respiratoire ynfeksjes by minsken.Ynklusyf persistente pandemyen feroarsake troch slimme akute ynfeksjesykten.Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4ââââ7).Nidoviruses diele in mienskiplike genome-organisaasje, en de subunit fan it membraan-bûne replikaasje-transkripsjekompleks (RTC) is kodearre yn 'e 5-?²-terminale twatredde en de wichtichste strukturele subunit fan it firusdieltsje, lykas guon aksessoires .Protein, kodearre yn it 3??² ein tredde fan it genom (1).Utsein ien famylje fan planarian firussen (Monoviridae) (8), kodearje alle geneste firussen RTC subunits yn twa grutte iepen lêsframes (ORF) ORF1a en ORF1b, dy't oerset út genomic RNA fan.ORF1a kodearret polyprotein (pp) 1a, en ORF1a en ORF1b kodearje tegearre pp1ab.Mei de algemiene dielname fan 'e haadprotease (Mpro) kodearre troch ORF1a, wurde sawol pp1a as pp1ab proteolytysk ferwurke yn in ferskaat oan net-strukturele aaiwiten (nsps), ek wol 3CLpro neamd, om't it homology hat mei de 3Cpro fan it picornavirus ( 9).Dizze nsp's wurde nei alle gedachten gearstald yn in grutte dynamyske RTC, katalysearje de synteze fan genomysk RNA (replikaasje) en in set fan subgenomysk RNA (transkripsje), en wurde brûkt om de ekspresje fan 'e ORF te koördinearjen streamôfwerts fan ORF1b (10? ? ?12).
De kearn RTC omfettet RNA-ôfhinklike RNA-polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) en ferskate RNA-ferwurkingsenzymen, dy't benammen kodearre binne yn ORF1b en yn 'e coronavirus-famylje It befettet nsp12-nsp16 en nsp9-nsp12 yn 'e famylje Arterioviridae (sjoch referinsje 10ââ 12).RdRp en HEL1 fertsjintwurdigje twa (ien fyfde) bewarre domeinen fan it fûgelnêstfirus en hawwe homology ûnder oare RNA-firussen.Core replikase wurdt leaud te wurde bystien troch oare subunits, ynklusyf ferskate lytse nsps frijlitten út 'e carboxy-terminal (C-terminal) regio fan pp1a, streamôfwerts fan Mpro (coronavirus nsp5 en arterial firus nsp4, respektivelik).Se hawwe beheinde famylje-spesifike beskerming en ferskate aktiviteiten (besjoen yn referinsje 10ââ12).
Relatyf resint waard in domein mei unike skaaimerken fan folchoardermotyf fûn oan 'e amino-terminus (N-terminus) neist RdRp yn alle geneste firussen, mar gjin oare RNA-firussen (16).Op grûn fan syn lokaasje en nukleotide transferase (nukleoside monofosfaat [NMP] transferase) aktiviteit, wurdt dit domein neamd NiRAN (Nestvirus RdRp-relatearre nukleotide transferase).De dual-domain-kombinaasje fan NiRAN-RdRp foarmet nsp12 yn 'e Coronaviridae-famylje en nsp9 yn' e Arterioviridae-famylje, en yn oare nestoviridae wurdt ferwachte dat NiRAN-RdRp frijjûn wurdt as in ûnôfhinklike nsp fan it virale polyprotein.Yn it coronavirus befettet it NiRAN-domein ??1/450-residuen en is ferbûn mei it C-terminale RdRp-domein fia de linkerregio (16?19).Yn Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), rekombinant nsp9 toant Mn2+ ion-ôfhinklike (sels) UMPylation en GMPylation aktiviteiten, dy't ôfhinklik binne fan trije bewarre folchoarder bases yn nestovirus, AN, BN en CN De resten yn de folchoarder.Wêr't N stiet foar NiRAN) (16).De N-terminale flankearring fan dizze motiven is in minder konservatyf motyf preAN.Guon fan dizze residuen wurde ek bewarre yn fier besibbe proteïnekinasen, wêr't se oantoand binne belutsen by nukleosidetrifosfaat (NTP) binende en katalytyske aktiviteit (20, 21).Yn oerienstimming mei dizze observaasje kinne ferskate wichtige aktive side-residuen yn 'e pseudokinase SelO fan Pseudomonas syringae wurde gearstald mei it koartlyn publisearre SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkompleks.Konservearre Coronavirus NiRAN-residuen boppe op 'e elektroanenmikrostruktuer.Rekombinant proteïne (17).It wurdt spekulearre dat de dokumintearre (sels) U / GMPylaasje in transiente steat sil produsearje om NMP oer te bringen nei it (op it stuit ûnbekende) substraat (16), en de strukturele oerienkomst tusken NiRAN en proteinkinase (17, 19) ) Is de hypoteze dat NiRAN feroaret oare aaiwiten.
In protte funksjes, ynklusyf syn unike en unike systematyske assosjaasje mei nestele firussen en genetyske skieding fan RdRp, meitsje NiRAN in ridlik kaai regulearjend enzyme foar nestede firussen, wat kritysk is foar har ûntstean en identiteit.Earder waarden trije mooglike funksjes mei NiRAN belutsen om genome / subgenomyske oersetting of replikaasje / transkripsje te regeljen.By it beskôgjen fan de knappe en ûnfolsleine gegevens dy't op it stuit beskikber binne, hat elke funksje syn foardielen en neidielen (16).Yn dit ûndersyk binne wy fan doel de biogemyske en omkearde genetyske stúdzjes te kombinearjen fan 'e coronaviruses dy't de twa genera fertsjintwurdigje, en ús befiningen yn' e evolúsjonêre eftergrûn fan 'e natuerlike mutaasje fan' e coronavirus-famylje te pleatsen, om ynsjoch te krijen yn dit Mysterieuze ryk.Wy rapportearje grutte foarútgong yn it begryp fan NiRAN troch de identifikaasje fan natuerlike doelen yn RTC, dy't (ûnder de trije beskikbere hypotezen) bydraacht oan de rol fan dit domein by it inisjearjen fan de synteze fan nested firus RNA.Dit ûndersyk iepenet ek mooglikheden foar oare rollen fan NiRAN op 'e firushost-ynterface.
Om de enzymatyske eigenskippen fan it korona-firus nsp12-relatearre NiRAN-domein te karakterisearjen, produsearren wy in rekombinante foarm fan minsklik coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 yn E. coli, mei in His6-tag oan 'e C-terminus, en kombineare de proteïne mei [α32-P] Incubate tegearre mei NTP yn 'e oanwêzigens fan MnCl2 lykas beskreaun yn Materialen en metoaden.De analyze fan it reaksjeprodukt oanjûn de oanwêzigens fan in radiolabeled proteïne dat ko-migreert mei nsp12 (106 kDa), wat oanjout dat coronavirus nsp12 de formaasje fan kovalente proteïne-NMP-addukten katalyseart, foarkar foarme mei uridinemonofosfaat (UMP) (figuer 1A) En B).Kwantitative analyze liet sjen dat yn ferliking mei oare nukleotiden de sinjaalintensiteit fan UMP-ynkorporaasje mei 2 oant 3 kear ferhege (figuer 1C).Dizze gegevens binne yn oerienstimming mei de foarseine NMP-transferase-aktiviteit fan it NiRAN-domein fan it coronavirus (16), mar jouwe oan dat de nukleotide-foarkarren fan it NiRAN-domein fan it coronavirus en it arteriële firus ferskillend binne.
Sels-NMPylaasjeaktiviteit fan HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) waard ynkubeare mei de oanwiisde [α-32P] NTP yn 'e oanwêzigens fan 6 mM MnCl2 foar 30 minuten (sjoch Materialen en metoaden foar details).De reaksje produkten waarden skieden troch SDS-PAGE en kleurde mei Coomassie briljant blau.(B) It radiolabele proteïne wurdt visualisearre troch phosphorous imaging.De posysjes fan nsp12-His6 en protein molekulêre massa markers (yn kilodaltons) wurde werjûn yn A en B. (C) De yntinsiteit fan it radioaktive sinjaal (gemiddeld ± SEM) waard bepaald út trije ûnôfhinklike eksperiminten.*P≤0,05.De sinjaalsterkte (persintaazje) is relatearre oan UTP.
Hoewol is oantoand dat NiRAN-relatearre enzymaktiviteiten essensjeel binne foar de replikaasje fan EAV en SARS-CoV yn selkultuer (16), binne de spesifike NiRAN-funksje en potensjele doelen noch net bepaald.De koartlyn rapportearre strukturele oerienkomst tusken NiRAN en in famylje fan aaiwiten mei proteïne kinase-like plooien (17, 22) frege ús om de hypoteze te testen dat NiRAN de NMPylaasje fan oare proteïnen katalysearret.Wy genereare in set fan potinsjele homologe doelen, ynklusyf net-strukturele aaiwiten kodearre troch HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), elk mei in C-terminal His6 tag (SI taheaksel, Tabel S1), En ynkubearje dizze aaiwiten mei [α32-P] uridine trifosfaat ([α32-P]UTP) yn 'e oanwêzigens of ôfwêzigens fan nsp12.Bovine serum albumin en MBP-LacZα fúzjeprotein produsearre yn E. coli tsjinne as kontrôles (figuer 2A, banen 1 oant 7).De radiolabeled proteïne waard analysearre troch natrium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) en autoradiography, en it waard fûn dat der wie in sterk radioaktyf sinjaal yn de reaksje mei nsp12 en nsp9.De posysje fan it sinjaal komt oerien mei de molekulêre massa fan nsp9, wat oanjout op nsp12-bemiddele UMPylaasje fan nsp9 (figuer 2B, spoar 7).Gjin oare testproteinen waarden fûn om UMPylearre te wêzen, wat ús liede om te konkludearjen dat nsp9 in spesifyk substraat fan nsp12 is.Yn oerienstimming mei de sels-NMPylaasjegegevens werjûn yn figuer 1, is nsp12 yn steat om alle fjouwer NMP's oer te dragen nei nsp9, hoewol de effisjinsje oars is, UMP> adenosinemonofosfaat (AMP)> guanosinemonofosfaat (GMP)> cytidinemonofosfaat (CMP)) ( Ofbylding).3 A en B).Under de betingsten brûkt yn dizze assay (ferkoart de reaksje en eksposysje tiid, ferminderje de konsintraasje fan nsp12; materialen en metoaden), koe de sels-NMPylaasje fan nsp12 net wurde ûntdutsen (fergelykje figuer 2B, baan 7, en figuer 1B), dy't bewiisde in effektyf (En meardere rûndes) UMP ferhuze fan nsp12 nei nsp9.UMP-transferase-aktiviteit fereasket de oanwêzigens fan Mn2+-ionen, lykas werjûn yn figuer 3C, wylst allinich minimale UMP-transferase-aktiviteit waard waarnommen yn 'e oanwêzigens fan Mg2+, en gjin aktiviteit yn' e oanwêzigens fan 'e oare twa divalente kationen dy't testen.Fergelykbere gegevens waarden krigen yn NMPylaasje-assays dy't cytidinetrifosfaat (CTP), guanosinetrifosfaat (GTP), en adenosinetrifosfaat (ATP) (SI taheaksel, figuer S1) befetsje.
HCoV-229E nsp12-bemiddele UMPylaasje fan nsp9.In searje proteïnesubstraten (ynklusyf bovine serumalbumine, MBP-lacZα, en in searje HCoV-229E nsps markearre mei C-terminal His6 kodearre troch ORF1a) waarden brûkt om de UMPylaasjeaktiviteit fan HCoV-229E nsp12-His6⁺-media te evaluearjen proteïne.Inkubearje it proteïne mei [α-32P] UTP foar 10 minuten yn 'e ôfwêzigens (A) of oanwêzigens (B) fan nsp12 lykas beskreaun yn' e materialen en metoaden.Oan 'e boppekant fan A en B wurdt SDS-polyacrylamide gel ferkleurd mei Coomassie Brilliant Blue werjûn, en oan' e ûnderkant fan A en B wurde de oerienkommende autoradiogrammen werjûn.De posysje fan 'e proteïne molekulêre massa marker (yn kilodaltons) wurdt jûn oan de linkerkant.De posysje fan nsp12-His6 (B, boppe) en it radioaktive sinjaal dat wurdt waarnommen tidens de ynkubaasje fan nsp12-His6 mei nsp9-His6 (B, baan 7) wurde ek oanjûn, wat oanjout dat [α-32P]UMP nei nsp9-His6 (12.9 kDa), dy't net waard waarnommen foar oare ûndersochte proteïnen.
HCoV-229E NiRAN-bemiddele biogemyske en virologyske karakterisaasje fan nsp9 NMPylaasje.(A en B) De rol fan it nukleotide-ko-substraat brûkt yn 'e reaksje.Nsp12-His6 en nsp9-His6 wurde mingd en ynkubeare yn 'e oanwêzigens fan ferskate [α-32P] NTP's yn 'e standert NMPylaasje-assay.(A, boppe) Coomassie-bevlekte nsp9-His6 skieden troch SDS-PAGE.(A, ûnder) Autoradiografy fan itselde gebiet fan 'e gel.(B) De relative aktiviteit (gemiddelde ± SEM) yn 'e oanwêzigens fan' e oanwiisde nukleotide-kofaktor wurdt bepaald út trije ûnôfhinklike eksperiminten.*P≤0,05.(C) De rol fan metaalionen.Toand is de standert NMPylaasjetest yn 'e oanwêzigens fan [α-32P] UTP en ferskate metaalionen, elk mei in konsintraasje fan 1 mM.Yn C, de top, Coomassie stained nsp9-His6 wurdt werjûn, en yn C, de ûnderkant, wurdt de oerienkommende autoradiography toand.De grutte fan it markearre proteïne (yn kilodaltons) wurdt links fan A en C werjûn. (D) De mutante foarm fan HCoV-229E nsp12-His6 dy't de oantsjutte aminosoerferfanging drage is yn [α-32P]UTP, lykas beskreaun yn Materialen en Metoaden.De radiolabele nsp9-His6 produsearre yn 'e NMPylaasjereaksje wurdt ûntdutsen troch phosphorylaasjeôfbylding (D, boppe).De relative aktiviteit yn ferliking mei it wylde type (wt) proteïne wurdt werjûn yn D, en de boaiem wurdt nommen as de gemiddelde (± SEM) fan trije ûnôfhinklike eksperiminten.Asterisks jouwe ferfangings fan net-konservearre residuen oan.(E) De firustiter yn 'e kultuersupernatant fan p1-sellen krigen 24 oeren nei ynfeksje waard bepaald troch plaque-assay.De codon-substitúsjes yn it NiRAN-domein fan 'e manipulearre HCoV-229E-mutant wurde oanjûn (residunûmering is basearre op har posysje yn pp1ab).De replikaasje-deficient RdRp aktive site mutant nsp12_DD4823 / 4AA waard brûkt as kontrôle.
Om in djipper begryp te krijen fan 'e aktive side fan NiRAN en de residuen te bepalen relatearre oan' e aktiviteit fan nsp9-spesifike NMP-transferase, hawwe wy mutaasjeanalyse útfierd, wêryn wy de konservative residuen yn 'e NiRAN AN-, BN- en CN-motiven ferfongen hawwe ( 16) It is Ala (SI taheaksel, figuer S2).Derneist waard de ynfloed fan konservative Arg-to-Lys of Lys-to-Arg substitúsjes yn twa gefallen evaluearre.As (negative) kontrôle wurde residuen dy't net of minder bewarre binne yn it NiRAN-domein fan coronaviruses en oare geneste firussen ferfongen troch Ala. BN) en D4280A (CN) signifikant ferminderet of sels elimineert nsp9 NMPylation fia nsp12, wylst aaiwiten mei konservative substitúsjes (R4178K), K4116R) behâlde 60% en 80% fan harren aktiviteit, wat oanjout dat de ûntspanning fan de beheiningen op harren respektive kant keatlingen is fysykchemysk gefoelich (figuer 3D).It ferfangen fan ferskate oare bewarre resten E4145A, D4273A, F4281A en D4283A is folle minder skealik, en nsp9 UMPylation wurdt mar matig fermindere.Fergelykbere resultaten waarden krigen yn nsp9 NMPylaasjereaksjes wêrby't oare NTP's (Figure 3D en SI taheaksel, figuer S3), befêstigje dat de waarnommen effekten op spesifike aminosoeren substitúsjes binne ûnôfhinklik fan it type nukleotide co-substraat brûkt.Dêrnei testen wy de mooglike ynfloed fan dizze nsp12-substitúsjes op 'e replikaasje fan coronaviruses yn selkultuer.Foar dit doel brûkten wy passende genetysk manipulearre komplementêre DNA (cDNA) sjabloanen klonen yn rekombinant faksiniafirus (23, 24) om 5 -7 sellen te transkripearjen.Titraasje fan ynfeksjeare firus neiteam produsearre yn dizze sellen liet sjen dat de measte HCoV-229E NiRAN-mutanten net mooglik wiene (figuer 3E).In groep net-leefbere virale mutanten omfettet alternativen dy't oantoand is dat se NMP-transferase-aktiviteit in vitro eliminearje of signifikant ferminderje (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), mar d'r binne twa oare alternativen (K4116R, E4145A) % reservearre?Harren in vitro NMPylaasjeaktiviteit suggerearret dat ekstra beheiningen belutsen binne.Likegoed produsearren twa oare mutaasjes (R4178K, F4281A) dy't in matige delgong yn NiRAN's in vitro NMPylaasjeaktiviteit fan NiRAN live firussen, lykwols, dizze firussen fermindere titers signifikant troch replikaasje.Yn oerienstimming mei de yn vitro-aktiviteitsgegevens werjûn yn figuer 3D, ferfangen fan fjouwer oare residuen dy't net bewarre binne yn coronavirus en/of oare nestelde firussen (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) produsearre libbensfetbere firussen. in matig fermindere titer yn ferliking mei it wylde type firus (figuer 3E).
Om te ûndersykjen oft NiRAN-bemiddele NMP-transferase-aktiviteit hinget ôf fan it aktive RdRp-domein, waarden de twa konservearre Asp-residuen belutsen by de koördinaasje fan divalente metaalionen (11) yn RdRp-motyf C ferfongen troch Ala. syn nsp9 NMPylaasjeaktiviteit, wat oanjout dat nsp12-bemiddele yn vitro nsp9 NMPylaasjeaktiviteit gjin polymerase-aktiviteit fereasket (SI Appendix, figuer S4).
Nei it fêststellen fan de nsp9-spesifike NMP-transferase-aktiviteit foar nsp12, besochten wy it NMP-nsp9-addukt te karakterisearjen troch massaspektrometry (MS).It folsleine proteïnemassaspektrum fan rekombinante HCoV-229E nsp9 toande in pyk by 12,045 Da (figuer 4A).De tafoeging fan nsp12 feroare de kwaliteit fan nsp9 net, wat oanjout dat nsp12 en nsp9 gjin stabyl kompleks sille foarmje ûnder de brûkte betingsten (denaturaasje) (figuer 4A).Yn 'e oanwêzigens fan UTP en GTP liet de massamjitting fan' e reaksje mei respektivelik nsp9 en nsp12 sjen dat de proteïnemassa fan UTP 306 Da beweech, en de proteïnemassa fan GTP 345 Da beweecht, wat oanjout dat elk nsp9-molekule in UMP of GMP bynt (Foto 4) C en D).Der wurdt spekulearre dat de enerzjy nedich foar NiRAN-bemiddele nsp9 NMPylaasje komt fan NTP-hydrolyse en pyrofosfaat frijlitting.Hoewol in 10-fâldige molêre oerskot fan nsp9 (doel) as nsp12 (enzyme) waard brûkt yn dizze reaksje, waard hast folsleine NMPylaasje fan nsp9 waarnommen, wat oanjout dat de ynteraksje tusken nsp12 en nsp9 koart is, en nsp12 kin NMPylearje mear nsp9 in vitro molekule.
Single NMPylaasje fan nsp9 yn 'e oanwêzigens fan nsp12 en UTP of GTP.Toand is it dekonvolutearre folsleine proteïnemassaspektrum fan HCoV-229E nsp9 (SI taheaksel, Tabel S1) (AD).(A) nsp9 allinich, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 yn 'e oanwêzigens fan UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 yn' e oanwêzigens fan GTP.
Om de nsp9-residuen te bepalen UMPylearre troch nsp12, waard nsp9-UMP knipt mei trypsin.De resultearjende peptiden waarden skieden troch nano-high performance liquid chromatography (HPLC) en analysearre troch tandem massaspektrometry (MS / MS) online.Gegevensanalyse mei it Byonic-softwarepakket (Protein Metrics) liet UMPylaasje sjen fan it N-terminale aminosoer.Dit wurdt mei de hân befêstige.It tandem massaspektrum fan it foarrinner peptide [UMP] NNEIMPGK (SI taheaksel, figuer S5A) iepenbiere in fragmint op 421 m / z, wat oanjout dat UMP bindet oan residu 1 fan nsp9.
Oan 'e N-terminus fan nsp9 wurdt Asn bewarre ûnder de leden fan Orthocoronavirinae (SI taheakke, figuer S6).Hoewol wy leauwe dat de N-terminale primêre aminestikstof de meast wierskynlike akseptor is foar UMP, hawwe wy besletten om ekstra bewiis te krijen fan NMP-bining by de N-terminal.Om dizze reden waard it net-NMPylearre en NMPylearre N-terminale peptide nsp9 suvere troch HPLC ôflaat yn 'e oanwêzigens fan aceton en natriumcyanoborohydride.Under dizze betingsten kinne allinich frije primêre aminen wizige wurde mei propyl (25).It N-terminale nsp9-ôflaat peptide mei de folchoarder NNEIMPGK befettet twa primêre amines, ien oan 'e N-terminus fan Asn en de oare oan' e sydketen fan Lys oan 'e C-terminus.Dêrom kinne propylgroepen oan beide einen ynfierd wurde.De ekstrahearre ionchromatogrammen fan net-NMPylearre peptiden wurde werjûn yn 'e SI-bylage, figuer S5B.Lykas ferwachte, kinne N-terminal en C-terminal (mono) propylated (SI taheaksel, figuer S5B, boppeste baan) en dipropylated peptiden (SI taheaksel, figuer S5B, legere baan) wurde identifisearre.Dit patroan feroaret mei it brûken fan it NMPylated N-terminale peptide fan nsp9.Yn dit gefal kinne allinich C-terminale propyleare peptiden identifisearre wurde, mar N-terminale propyleare peptiden en dipropyleare peptiden wurde net identifisearre (SI Appendix, figuer S5C), wat oanjout dat UMP is oerbrocht nei it N-terminale primêre amine. groep fan it meitsjen fan feroarings.
Dêrnei ferfange wy (mei Ala of Ser) of wiskje de bewarre residuen oan 'e N-terminus fan nsp9 om doelspesifike beheiningen te definiearjen.Op grûn fan ús MS-gegevens dy't sjen litte dat NiRAN in nsp9-NMP-addukt foarmet mei it primêre amine fan it N-terminale residu fan nsp9, hawwe wy hypoteze dat nsp9 NMPylaasje de virale masterprotease (Mpro, nsp5) fereasket om de nsp9 N-terminal frij te meitsjen fan syn polyprotein foarrinner.Om dizze hypoteze te testen, produsearren wy in foarrinnerprotein nsp7-11 mei nsp9 yn E. coli en hawwe in standert NMPylaasjetest útfierd yn 'e oanwêzigens fan [α-32P] UTP (materialen en metoaden).Lykas werjûn yn figuer 5A (baan 3), is de uncut nsp7-11 foarrinner net radiolabeled mei nsp12.Yn tsjinstelling, as nsp7-11 wurdt knipt troch rekombinante nsp5 om nsp9 (en oare nsps) frij te meitsjen fan 'e foarrinner, wurdt in radiolabeled proteïne dat migreart mei nsp9 ûntdutsen, wat ús konklúzje befêstiget dat NiRAN en N-Selektive formaasje fan kovalente nsp9-NMP-addukten .De terminale primêre amine fan 'e N-terminale Asn (posysje 3825 yn pp1a / pp1ab).Dizze konklúzje wurdt ek stipe troch eksperiminten mei it nsp9-konstruksje, dat ien of twa ekstra residuen oan 'e N-terminus befettet.Yn beide gefallen waard NiRAN-bemiddele UMPylaasje fan nsp9 ôfskaft (SI Appendix, figuer S7).Dêrnei produsearren wy in proteïne mei ien of twa Asn-residuen wiske fan 'e 3825-NNEIMPK-3832-peptidesekwinsje oan' e N-terminal fan nsp9.Yn beide gefallen waard nsp9 UMPylaasje folslein blokkearre (figuer 5B), wat ekstra bewiis leveret dat de echte nsp9 N-terminus fungearret as in NMP-receptor.
De proteolytyske ferwurking fan nsp9 en de rol fan N-terminale residuen yn nsp12-mediated UMPylation.(A) nsp9 UMPylaasje fereasket in frije nsp9 N-terminal.Nsp7-11-His6 wurdt pre-ynkubearre by 30 ° C yn NMPylaasje-deteksjebuffer mei UTP yn 'e oanwêzigens of ôfwêzigens fan rekombinante Mpro (nsp5-His6).Nei 3 oeren, begjin de NMPylaasje-assay troch nsp12-His6 ta te foegjen lykas beskreaun yn Materialen en metoaden.De reaksje mei nsp5-His6 (baan 1) en nsp9-His6 (baan 2) waard brûkt as kontrôle.Nei 10 minuten waard de reaksje beëinige en it reaksjegemik waard skieden troch SDS-PAGE.It proteïne waard kleurd mei Coomassie Brilliant Blue (A, boppe).De Nsp7-11-His6 foarrinner en it ferwurke produkt dat ûntstiet út nsp5-His6 mediated spalting wurde rjochts werjûn.Tink derom (fanwegen har lytse grutte) dat nsp7 en nsp11-His6 yn dizze gel net te detektearjen binne, en de reaksje wurdt oanfolle mei nsp5-His6 (banen 1 en 4; de posysje fan nsp5-His6 wurdt oanjûn mei in fêste sirkel) of nsp9-His6 (Lane 2) befettet in lyts bedrach fan MBP (oanjûn troch iepen sirkels) as oerbleaune ûnreinheden omdat se wurde útdrukt as MBP fusion aaiwiten (SI taheaksel, Tabel S1).(B) De Nsp9-His6-fariant mist ien of twa N-terminale Asn-residuen (residunûmering neffens de posysje yn pp1a/pp1ab) en wurdt suvere en ynkubeare mei nsp12-His6 en [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE bevlekt mei Coomassie wurdt oan 'e boppekant werjûn, B, de korrespondearjende autoradiograaf wurdt oan' e ûnderkant werjûn.De posysje fan de molekulêre gewicht marker (yn kilodaltons) wurdt werjûn oan de linkerkant.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminale bewarre residuen waarden ferfongen troch Ala of Ser, en deselde hoemannichte proteïne waard brûkt yn 'e nsp12-His6 mediated UMPylation reaksje.De reaksjeprodukten waarden skieden troch SDS-PAGE en kleurd mei Coomassie Brilliant Blue (C, boppe), en radiolabeled nsp9-His6 waard ûntdutsen troch phosphorescence imaging (C, midden).Mei help fan wyldtype (wt) proteïne as referinsje (ynsteld op 100%), waard de relative NMPylaasjeaktiviteit (gemiddelde ± SEM) berekkene út trije ûnôfhinklike eksperiminten.(D) Virustiters yn 'e p1-selkultuer-supernatant fan Huh-7-sellen ynfekteare mei HCoV-229E wyldtype Huh-7-sellen, en mutanten dy't oanwiisde aminosûrferfangings yn nsp9 drage, waarden bepaald troch plaque-assay.De replikaasje-deficient RdRp motyf C dûbele mutant DD4823 / 4AA waard brûkt as in negative kontrôle.
De N-terminus fan nsp9 (benammen posysjes 1, 2, 3 en 6) is tige bewarre bleaun ûnder leden fan 'e Orthocoronavirinae subfamylje (SI taheakke, figuer S6).Om de mooglike rol fan dizze residuen te studearjen yn nsp12-bemiddele nsp9 NMPylaasje, waarden twa opfolgjende Asn-residuen oan 'e N-terminus fan nsp9 ferfongen troch Ala of Ser (allinich as yn kombinaasje).Yn ferliking mei wyld-type nsp9, it ferfangen fan N3825 mei Ala of Ser resultearre yn mear as in twa-fold reduksje yn nsp12-bemiddele UMPylaasje (figuer 5C).Yn oerienstimming mei ús konklúzje dat NMPylaasje foarkomt by it N-terminale primêre amine ynstee fan 'e sydketen fan it N-terminale residu, hawwe wy signifikante residuele NMPylaasje observearre mei de ferfanging fan N3825A en N3825S.Nijsgjirrich, as de twadde Asn wurdt ferfongen troch Ala of Ser, nsp9 UMPylation wurdt fermindere sterker (mear as 10 kear), wylst it ferfangen fan Ala op posysjes 3, 4, en 6 hat mar in matige effekt op nsp9 UMPylation (figuer 2) ).5C).Fergelykbere resultaten waarden krigen mei ATP, CTP of GTP (SI taheakke, figuer S8).Mei-elkoar jouwe dizze gegevens de kaairol oan fan N2826 (posysje 2 yn nsp9) yn nsp9 NMPylaasje.
Om ekstra bewiis te krijen fan 'e funksjonele korrelaasje tusken de N-terminus fan nsp9 en NMPylaasje, hawwe wy in meardere folchoarderôfstimming (MSA) útfierd fan' e nsp9-sekwinsje fan 'e Coronavirus-famylje (fariearjend tusken 104 en 113 residuen) (SI Appendix, Fig. S6).Yn totaal, yn 47 (bekende en putative) soarten fan 5 genera fan 'e Orthocoronavirinae subfamylje dy't ferskate sûchdieren, fûgels en reptilen hosts ynfektearje, waarden yn totaal mar 8 residuen fûn om ûnferoarlik te wêzen.De meast wiidweidige feroaringen, ynklusyf deletions en ynfoegingen, waarden beoardiele yn 'e syklusen tusken de sekundêre struktuereleminten fan nsp9, lykas bepaald troch eardere strukturele stúdzjes (26 ??28).Fiif invariante residuen waarden fûn yn 'e β-strân en α-helix fan it C-terminale diel fan nsp9.Trije invariante resten foarmje it NNE-motyf fan 'e N-terminus fan nsp9.It wurdt iepenbiere dat de twadde Asn fan dit motyf it ienige ûnferoarlike residu is, dat ek dield wurdt troch de hypotetyske nsp9 fan it fier besibbe kikkertkoronavirus, en fertsjintwurdiget de Microhyla letovirus 1-soarte yn 'e subfamylje Letovirinae fan Alphaletovirus.It behâld fan residuen yn nsp9-sekundêre struktuer-eleminten kin wurde rationalisearre troch strukturele oerwagings om folding of bekende RNA-binende eigenskippen te behâlden.Dizze redenearring liket lykwols net fan tapassing te wêzen foar it behâld fan NNE, en foarôfgeand oan dizze stúdzje waard de natuer fan 'e beheiningen dy't de fariaasje fan' e tripeptide-sekwinsje beheine, folslein ferburgen.
Om it belang te bepalen fan nsp9-NMPylaasje en NNE-behâld yn replikaasje fan coronavirus, produsearren wy HCoV-229E-mutanten, dy't inkele of dûbele substitúsjes drage fan nsp9 N-terminale residuen, wat oanjout dat nsp9 NMPylaasje skealik is in vitro.Foardat wy begjinne, besykje wy de fraach te beantwurdzjen oft dizze substitúsjes (tichtby de nsp8|9-spaltingsside) ynfloed hawwe op de proteolytyske ferwurking fan 'e C-terminale pp1a-regio.In set fan nsp7-11 polyprotein konstruksjes dy't oerienkommende substitúsjes befetsje oan 'e N-terminus fan nsp9 waarden produsearre yn E. coli en snijden mei rekombinante Mpro.De proteolytyske spalting fan 'e fjouwer siden (ynklusyf de nsp9-flankearjende side) wurdt net signifikant beynfloede troch alle yntrodusearre substitúsjes (SI-appendix, figuer S9), útsein strukturele feroarings yn dizze aaiwiten dy't ynterferearje mei Mpro-bemiddele nsp8 | 9-spjalting (Of oare) webside.
Huh-7-sellen waarden transfekteare mei genome-lingte HCoV-229E RNA, kodearje foar Ala- as Ser-substitúsjes yn 'e bewarre NNE-tripeptiden (N3825, N3826, en E3827) oan' e nsp9 N-terminus, wat toant dat de measte mutaasjes fataal binne.Wy koene it firus rêde troch de Ser of Ala fan 'e N-terminal Asn (N2835A of N2835S) te ferfangen, mar slagge it net om it firus te herstellen mei oare inkele en dûbele mutaasjes yn 'e NNE-sekwinsje (N3826A, N3826S, NN3825 / 6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (figuer 5D).
Dizze resultaten jouwe oan dat de replikaasje fan coronaviruses yn weefselkultuer is beheind (itselde as ferlykber), beheine de natuerlike mutaasje fan nsp9 NMPylaasje-sites yn it lichem, en stypje de kaairol fan dizze reaksje yn 'e libbenssyklus fan coronaviruses.
Yn 'e lêste set fan eksperiminten produsearren wy C-terminal His6 markearre SARS-CoV-2 nsp12 en nsp9, en twa mutante foarmen fan nsp12 yn E. coli.De aktive side-residuen yn 'e NiRAN- en RdRp-domeinen waarden respektivelik Ala brûke ynstee (figuer 6A en SI taheaksel, Tabel S2).K4465 yn SARS-CoV-2 nsp12 komt oerien mei K4135 yn HCoV-229E (SI-oanhangsel, figuer S2), dy't bliken te wêzen fereaske foar NiRAN-aktiviteit en HCoV-229E-replikaasje (figuer 3D en E).Dit residu komt ek oerien mei it arteriële firus EAV nsp9 K94-residu, dat earder toand wie nedich foar NiRAN sels-UMPylaasje / sels-GMPylaasje (16).Lykas werjûn yn figuer 6B, hat SARS-CoV-2 nsp12 UMP-transferase-aktiviteit mei nsp9 as substraat, wylst de nsp12_K4465A aktive sitemutant ynaktyf is.De dûbele substitúsje yn 'e SDD-karakteristike folchoarder fan RdRp-motyf C hat gjin ynfloed op UMP-transferase-aktiviteit (figuer 6B), wat oanjout dat RdRp-aktiviteit gjin direkte effekt hat yn nsp9 UMPylaasje.Fergelykbere gegevens waarden krigen mei CTP, GTP en ATP (SI taheakke, figuer S10).Gearfetsjend jouwe dizze gegevens oan dat NiRAN-bemiddele nsp9 NMPylaasje in konservative aktiviteit hat yn coronaviruses dy't ferskate genera fan 'e orthocoronavirus subfamylje fertsjintwurdigje.
SARS-CoV-2 nsp12-bemiddele NMPylaasje fan nsp9.(A) Coomassie kleurde SDS-polyacrylamide gel dy't it rekombinante proteïne toant brûkt yn 'e NMPylaasjetest.As kontrôle waard in mutant proteïne mei aktive sidesubstitúsje yn it NiRAN-domein (K4465A) en RdRp-domein (DD5152/3AA) fan SARS-CoV-2 nsp12 brûkt.Residue nûmering is basearre op posysje yn pp1ab.(B) Autoradiografy fan UMPylaasje-deteksje mei nsp9-His6 en [α-32P]UTP as it substraat fan nsp12-His6 (wylde type [wt] en mutant).De molekulêre massa (yn kilodaltons) fan it markearre proteïne wurdt links werjûn.
NiRAN-domeinen wurde oer it generaal bewarre yn Nidovirales (16), wat oanjout dat se enzymatyske reaksjes katalysearje dy't essensjeel binne foar Nidovirus-replikaasje.Yn dizze stúdzje wiene wy yn steat om te bewizen dat it NiRAN-domein fan it coronavirus NMP (generearre fan NTP) oerbrocht nei nsp9, in mysterieus RNA-binend proteïne belutsen by firusreplikaasje (26 ?? 29 ), om it te bepalen as in natuerlik doel en partner fan coronavirus RTC.
It NiRAN-domein dielt trije folchoardermotiven (AN, BN, en CN), dy't in heul lyts oantal residuen befetsje dy't yn alle famyljes bewarre wurde yn 'e monofyletyske, mar tige differinsearre Nidovirales-oarder (8, 16).Resinte ûndersiken hawwe oantoand dat se struktureel besibbe binne oan in foar it grutste part net-karakterisearre famylje fan proteïne kinase-like proteïnen, dy't oarspronklik de SelO-famylje neamd waarden (17, 19, 22, 30, 31).SelO-relatearre aaiwiten hawwe kinase-folden, mar ûntbrekke ferskate bewarre aktive side-residuen yn klassike kinasen (22, 32).Op grûn fan 'e omkearde oriïntaasje fan ATP-molekulen bûn oan' e aktive side en stabilisearre troch spesifike ynteraksjes, waard SelO hypoteze makke en dêrnei befêstige om AMP (ynstee fan fosfaat) oer te bringen nei it proteïnesubstraat (22), wylst in oar baktearjele SelO-like proteïne YdiU hat koartlyn is oantoand om de kovalente hechting fan UMP oan Tyr en His residuen fan ferskate proteinsubstraten te katalysearjen (33).
Om de foarsizzing te befêstigjen en út te wreidzjen fan 'e putative aktive side-residuen fan it coronavirus NiRAN-domein, brûkten wy biogemyske en reverse genetyske metoaden om mutaasjeanalyse út te fieren op' e coronavirus nsp12 (figuer 3D en E en SI taheaksel, figuer S3 en tabel) S1â S4).De gegevens litte sjen dat de ferfanging fan HCoV-229E K4135, R4178 en D4280 mei Ala elimineert in vitro NMP-transferase-aktiviteit en firusreplikaasje yn selkultuer (figuer 3D en E en SI taheaksels, figuer S3), en stypje har oanwêzigens yn NTP γ-fosfaat (K4135, R4178) en de koördinaasje fan aktive site metaal ioanen (D4280).De E4145A-ferfanging fan 'e bewarre Glu yn' t berik fan it fûgelnêstfirus foarsein om de posysje fan K4135 (17) te stabilisearjen waard oantoand om virale replikaasje te eliminearjen, mar ferrassend waard de aktiviteit behâlden yn 'e in vitro NMPylaasje-assay (figuer 3D en E en SI taheakke, figuer S3 en tabellen S1-S4).In fergelykbere observaasje waard makke doe't de oerienkommende substitúsje yn 'e YdiU-homolooch fan Salmonella typhimurium (E130A) yntrodusearre waard (33).Mei-inoar stypje dizze gegevens de regeljende funksje fan dit bewarre residu ynstee fan de katalytyske funksje.
It ferfangen fan it bewarre Phe-residu (F4281A) binnen it berik fan nestovirus yn it HCoV-229E NiRAN-domein (8) resultearre yn in fermindering fan NMPylaasjeaktiviteit in vitro en in signifikante fermindering fan firusreplikaasje yn selkultuer (figuer 3D, E en SI) bylage, figuer S3).De gegevens binne yn oerienstimming mei de wichtige regeljende funksje fan dit residu, lykas it homologe DFG-motyf Phe-residu earder werjûn.Yn klassike proteïnekinasen is it diel fan 'e Mg2+ bindende loop en helpt om de rêchbonke te sammeljen en te regeljen???Fereaske foar effektive katalytyske aktiviteit (32, 34).It ferfangen fan Ala en Arg foar K4116-residuen (yn it preAN-motyf), respektivelik, elimineare virale replikaasje en hie, lykas ferwachte, ferskate effekten op NMP-transferase-aktiviteit in vitro, ôfhinklik fan 'e yntrodusearre aminosoeren-sideketen (figuer 3D en E en SI taheaksels , figuer S3).De funksjonele gegevens binne yn oerienstimming mei de strukturele ynformaasje, wat oanjout dat dit residu in ynteraksje mei ATP-fosfaat hat (17).Yn it NiRAN-domein fan oare geneste firusfamyljes wurdt de posysje fan HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 beset troch Lys, Arg of His (8), wat oanjout dat de funksjonele beheining fan dit spesifike residu ûntspannen is.De ferfanging fan D4188A en D4283A elimineert of sterk ferminderet enzymaktiviteit en elimineert firusreplikaasje (figuer 3).Dizze twa resten wurde bewarre yn 'e measte (mar net alle) nestele firussen (8), wat oanjout op in wichtige famylje-spesifike, mar mooglik net-katalytyske funksje.Ala-substitúsjes fan ferskate oare Lys- en Asp-residuen (K4113A, D4180A, D4197A en D4273A) dy't net bewarre binne yn 'e Coronaviridae of oare Nestioviridae-famyljes (8) waarden brûkt as kontrôles.Lykas ferwachte binne dizze substitúsjes foar in grut part tolerabel, mei in lichte fermindering fan enzymaktiviteit en virale replikaasje yn guon gefallen (figuer 3 en SI taheaksel, figuer S3).Oer it algemien binne de gegevens oer mutagenese fan coronavirus heul konsistint mei de sels-GMP en reverse genetyske gegevens fan EAV NiRAN-RdRp (16), wêryn EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) residu K94 (oerienkomt mei HCoV-229E K4135) wichtige funksjes), R124 (oerienkommende mei R4178), D132 (oerienkommende mei D4188), D165 (oerienkommende mei D4280), F166 (oerienkommende mei F4281).Derneist binne de HCoV-229E-mutagenesegegevens konsistint mei en útwreide fan 'e earder rapporteare SARS-CoV-reverse genetyske gegevens (16), krekt sa heul gelyk oan dy observearre foar it korrespondearjende CN-motyf Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12. fenotype beskreaun -F219A en HCoV-229E_F4281A (figuer 3 D en E en SI taheaksel, figuer S3 en tabel S1-S4).
Yn ferliking mei EAV-ortologen (16), dy't in dúdlike foarkar hawwe foar UTP en GTP (yn 'e sels-NMPylaasjereaksje), lit ús stúdzje sjen dat it coronavirus NiRAN-domein (fertsjintwurdige troch HCoV-229E en SARS-CoV-2) effektyf kin wêze oerdroegen Alle fjouwer NMPs, hoewol't der in lichte foarkar foar UMP (figueren 1 en 3).De relatyf lege spesifisiteit fan it spesifike NTP co-substraat is yn oerienstimming mei de koartlyn rapporteare SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomposite struktuer, wêryn ADP-Mg2+ bynt oan de aktive side fan NiRAN, mar net mei adenine Part fan 'e foarming fan spesifike ynteraksjes (17).Yn ús stúdzje hat it type nukleotide dat brûkt wurdt yn 'e NMPylaasjereaksje gjin differinsjaal effekt op' e aktiviteit fan 'e mutante proteïne (SI Appendix, Figure S3), wat oanjout dat gjin fan dizze resten nau besibbe binne oan de bining fan in spesifike nucleobase.De strukturele basis en potinsjele biologyske betsjutting fan 'e ferskate NTP co-substraat foarkarren waarnommen yn' e NiRAN domeinen fan coronaviruses en arteriële firussen bliuwe te bestudearjen;se kinne wier wêze of kinne wêze troch de beheiningen fan har respektive stúdzjes.Op it stuit kin it net útsletten wurde dat de potinsjele NMPylator-aktiviteit fan it arteriële firus NiRAN-domein (yn ferliking mei de earder karakterisearre sels-NMPylaasje-aktiviteit) in oare co-substraat foarkar hat, rekken hâldend mei dat de oerienkomst tusken it arteriële en it coronavirus NiRAN-domein is op syn limyt.Sequence-basearre Ferlykje (16).Yn ferliking mei de pseudokinase SelO, dy't Mg2+ as kofaktor brûkt, is de aktiviteit fan coronavirus en arteriële firus NiRAN ôfhinklik fan Mn2+ (16) (Figure 3C en SI taheaksel, figuer S1).De Mn2+ ôfhinklikens en foar de hân lizzende foarkar foar UTP is in ûngewoane skaaimerk fan proteïne NMPylators, en is pas koartlyn befêstige yn it YdiU proteïne fan Salmonella typhimurium, dy't de strange Mn2+ ôfhinklike proteïne chaperone UMPylaasje katalysearret om sellen te beskermjen tsjin stressinduksje Cell ATP pool ( 33).
De koartlyn beskreaune strukturele oerienkomst tusken it NiRAN-domein fan it coronavirus en sellulêre proteïnekinasen (17, 19) leveret ekstra stipe foar NiRAN's fermogen om NMP kovalent te keppeljen oan oare proteïnen dy't wy hawwe rapporteare yn dizze stúdzje.Wy rjochte ús syktocht nei mooglike NiRAN-doelen op 'e proteïnen kodearre troch HCoV-229E ORF1a, dy't bekend binne om direkt of yndirekt de ORF1b-kodearre replikase fan RTC te helpen (12, 35).Us eksperiminten jouwe konklúzjend bewiis foar de effektive en spesifike NMPylaasje fan nsp9 (figuer 2).As it doelprotein brûkt wurdt yn in molêre oerskot dy't 8 oant 10 kear heger is as dy fan it enzyme (nsp12), wurdt befêstige dat nsp9 folslein (mono)NMPisearre is (figuer 4).Wy konkludearren dat de ynteraksje tusken nsp12 en nsp9 koart libben is en gjin stabile kompleks sil foarmje mei nsp9 (by it ûntbrekken fan oare RTC-subunits).Dizze konklúzje wurdt stipe troch proteïne-ynteraksjestúdzjes oer it SARS-CoV-proteoom (35).MS-analyze identifisearre it primêre amine fan it N-terminale residu fan nsp9 as de NMPylaasje-side (SI taheakke, figuer S5).De formaasje fan 'e fosforamidaatbân en de N-terminale aminogroep ûnderskiedt de NiRAN-bemiddele NMPylaasjeaktiviteit fan 'e Pseudomonas syringae SelO-bemiddele AMPylaasjereaksje, dy't de formaasje fan O-keppele AMP by Ser, Thr, of Tyr-residuen Peptide-addukt katalysearret ( 22), en S. typhimurium YdiU foarmet O-keppele (mei Tyr) en N-keppele (mei His) peptide-UMP-addukten.De beheinde ynformaasje beskikber oer de SelO-famylje fan proteïnen jout oan dat leden fan dizze grutte proteïnefamylje sterk ferskille yn 'e formaasje fan peptide-NMP-addukten.Dit is in nijsgjirrige observaasje dy't fierdere stúdzje fertsjinnet.
De gegevens krigen yn dizze stúdzje liede ús ta hypoteze dat de NMPylaasje fan nsp9 in frije N-terminus fereasket.Yn 'e kontekst fan virale replikaasje sil dit wurde levere troch de proteolytyske splitsing fan' e nsp8|nsp9-ferwurkingsside yn 'e replikase polyprotein pp1a bemiddele troch Mpro en pp1ab.Yn 'e measte coronaviruses is it ferskil tusken dizze spesifike side (VKLQ | NNEI yn HCoV-229E) en alle oare Mpro-spaltingssiden fan coronavirus Asn (ynstee fan in oar lyts residu, lykas Ala, Ser Or Gly) besette P1â???Lokaasje (36).De peptide-spaltingsgegevens krigen yn 'e iere stúdzjes lieten sjen dat de spalting-effisjinsje fan' e nsp8|nsp9-side leger wie as dy fan oare siden, wat oanjout dat 1) dizze spesifike side in regeljende rol kin hawwe yn 'e tydlike koördinearre ferwurking fan' e C-terminal pp1a-regio, of 2) a De rol fan 'e spesjale bewarre nsp9 N-terminus yn firusreplikaasje (37).Us gegevens (figuer 5A) lieten sjen dat de rekombinante foarm fan nsp9 dy't de echte N-terminale folchoarder draacht, effektyf NMPisearre waard troch nsp12.De N-terminale flankearjende folchoarder waard fuortsmiten troch faktor Xa (nsp9-His6; SI taheaksel, Tabel S1) of Mpro-mediated spalting (nsp7-11-His6; figuer 5A en SI taheaksel, Tabel S1).Wichtich toande de ûnbesnien nsp9-befette foarrinner nsp7-11-His6 ferset tsjin NMPylaasje fan nsp12, wat oerienkomt mei ús gegevens, wat oanjout dat it nsp9-NMP-addukt wurdt foarme troch it N-terminale primêre amine (SI taheakke, figuer S5) .Om in djipper begryp te krijen fan NiRAN-substraatspesifisiteit, rjochte wy ús doe op 'e neistlizzende N-terminale resten fan nsp9.By it ûntbrekken fan oare aaiwiten binne se struktureel fleksibel, wêrtroch't se foarkomme dat se ûntdutsen wurde yn 'e unlabelde foarm fan nsp9 (26 28, 38), wat har beheinde natuerlike fariaasje oanjout. funksje fan it nsp9 N-terminale fragmint.Ala-substitúsjes fan bewarre residuen yn dizze regio (figueren 5C en D en SI taheaksel, figuer S8) litte sjen dat N3826 essensjeel is foar nsp9 NMPylaasje in vitro, wylst N3825A en E3827A substitúsjes liede ta in fermindering fan NMPylaasje, wylst M3829A en P3830A substitúsjes net dogge .Fansels beynfloedzje nsp9 NMPylaasje.Hoewol de substitúsje fan N-terminal Asn (N3825A, N3825S) mar in matige effekt hat op nsp9 NMPylaasje en firusreplikaasje yn selkultuer (figuer 5C en D), is it wiskjen fan in Asn-residu-sekwinsje fan it N-terminale 3825-NN-dipeptide bewiisd te wêzen It is deadlik foar firussen, wat oanjout dat ien Asn-residu fereaske is foar in oar residu op 'e N-terminus, leafst Asn, hoewol it liket dat substitúsje fan ferlykbere residuen foar in part tolerearre wurde kin (figuer 5B, C, en D).Wy konkludearje dat it 3825-NN-dipeptide, benammen it bewarre en essensjele N3826-residu binnen it coronavirus-berik (SI-appendix, figuer S6), soarget foar de juste bining en oriïntaasje fan 'e nsp9 N-terminus yn' e aktive side fan NiRAN.
It ferfangen fan Ala (E3827A) foar de bewarre Glu fan alle subfamyljes behâldt nsp9 NMPylaasje in vitro, mar is deadlik foar firussen yn selkultuer (figuer 5C en D), wat de ekstra funksje fan dit residu oanjout, bygelyks yn kaai ynteraksjes (NMPylearre as net wizige) ) nsp9 N-terminus en oare faktoaren belutsen by firusreplikaasje.Nsp9-mutaasjes hiene gjin ynfloed op it proteolytyske proses fan nsp9 of in neistlizzende nsps (39) (SI-appendix, figuer S9), wat oanjout dat de deadlike fenotypen fan ferskate waarnommen nsp9-mutaasjes net waarden feroarsake troch de dysregulaasje fan it C-proteolytyske proses-terminale pp1a-gebiet .
De boppesteande gegevens jouwe bewiis dat nei Mpro-bemiddele behanneling fan 'e nsp8|9-splitsingsside yn pp1a/pp1ab, de N-terminus fan nsp9 UMPylearre wurde kin (of foar in part wizige mei in oare NMP).Derneist hawwe it treflike behâld fan 'e N-terminus fan nsp9 (ynklusyf de ientallige en ûnferoarlike Asn-residuen yn' e famylje fan coronavirus) en de reverse genetyske gegevens krigen yn dizze stúdzje (figueren 3E en 5D) ús liede ta konklúzje dat de beskreaune nsp9 NMPylaasje is biologysk besibbe en essensjeel foar replikaasje fan coronavirus.De funksjonele gefolgen fan dizze wiziging bliuwe te bestudearjen, bygelyks oangeande de earder beskreaune (net-spesifike) nsp9 (ûnmodifisearre foarm) RNA-binende aktiviteit (2628).N-terminale NMPylaasje kin ek ynfloed hawwe op de ynteraksje fan nsp9 mei proteïne of RNA-substraten as de formaasje fan ferskate fjouwer-nivo-assemblies.Dizze binne waarnommen yn strukturele stúdzjes en binne befêstige dat se funksjoneel relatearre binne oan replikaasje fan coronavirus, hoewol foaral yn it ûntbrekken fan Yn it gefal fan dizze modifikaasje (26- ââ29, 40).
Hoewol de doelspesifisiteit fan it NiRAN-domein fan it coronavirus noch yn mear detail karakterisearre wurde moat, litte ús gegevens sjen dat de proteïnedoelspesifisiteit fan it NiRAN-domein fan it coronavirus heul smel is.Hoewol it behâld fan wichtige aktive side-residuen (8, 16) yn it NiRAN-domein fan alle nidovirus-famyljes de aktiviteit fan 'e bewarre NMPylator dizze aaiwiten sterk stipet, bliuwt de identiteit fan' e substraatbindende pocket-residuen fan dit domein. , en kin ferskille tusken ferskate famyljes fan Nidovirales doelen.Op deselde manier moatte de relevante doelen fan oare geneste firussen noch wurde bepaald.Se kinne op ôfstân orthologen wêze fan nsp9 of oare aaiwiten, om't de sekwinsjes bûten de fiif replikase-domeinen dy't oer it algemien bewarre wurde yn nestele firussen minder bewarre binne (8), ynklusyf de genome-array tusken Mpro en NiRAN, ûnder harren is nsp9 yn 'e corona firus.
Derneist kinne wy op it stuit de mooglikheid net útslute dat it NiRAN-domein ekstra (ynklusyf sellulêre) doelen hat.Yn dit gefal is it it neamen wurdich dat de baktearjele homologen yn dit opkommende proteïne NMPylators (NMPylators) (30, 31) lykje te hawwen "master tafersjochhâlders"?NMP modulearret in ferskaat oan sellulêre aaiwiten om har downstream-aktiviteiten te regeljen of te eliminearjen, en spielet dêrmei in rol yn in ferskaat oan biologyske prosessen, lykas sellulêre stress-antwurd en redox-homeostasis (22, 33).
Yn dizze stúdzje (figueren 2 en 4 en SI-bylage, figueren S3 en S5), koenen wy bewize dat nsp12 it UMP (NMP) diel oerbrocht nei in inkele (konservearre) posysje yn nsp9, wylst oare aaiwiten net wizige waarden yn 'e brûkt Under de betingsten wurdt goed definiearre (ynstee fan losse) substraat spesifisiteit stipe.Yn oerienstimming mei dit, fergelike mei N-terminale nsp9 NMPylaasje, nsp12's eigen NMPylaasjeaktiviteit is heul leech, de deteksje fereasket langere autoradiografy eksposysjetiid, en in 10-fâldige ferheging fan nsp12-konsintraasje wurdt brûkt.Derneist slagge ús MS-analyze gjin bewiis foar NMPylaasje fan nsp12, wat suggerearret dat NiRAN-domein sels-NMPylaasje (op syn bêst) in sekundêre aktiviteit is.It moat lykwols opmurken wurde dat oare stúdzjes foarriedige bewiis hawwe levere dat de sels-AMPylaasjestatus fan baktearjende NMPylator har NMPylaasjeaktiviteit op oare proteïnesubstraten kontrolearje kin (22, 33).Dêrom is mear ûndersyk nedich om de mooglike funksjonele effekten te ûndersykjen fan sels-NMPylaasjeaktiviteiten rapporteare foar EAV nsp9 (16) en coronavirus nsp12 (dizze stúdzje), ynklusyf it foarstelde chaperone-like effekt op it foldjen fan it C-terminal RdRp-domein ( 16)).
Earder binne ferskate hypotezen oangeande de mooglike streamôfwertsfunksjes fan it nidovirale NiRAN-domein beskôge, ynklusyf RNA-ligase, RNA-capped guanylate transferase en protein-priming-aktiviteit (16), mar gjinien fan har is kompatibel mei de beskikbere downstream-funksjes.De ynformaasje krigen yn 'e folgjende posysjes is krekt deselde tiid sûnder ekstra oannames te meitsjen.De gegevens krigen yn dizze stúdzje binne it meast konsistint mei (mar kin net bewize) dat it NiRAN-domein belutsen is by it inisjearjen fan protein-induzearre RNA-synthese.It waard earder leaud dat de funksje fan it NiRAN-domein yn 5 ??²-RNA-kappen as RNA-ligaasjereaksjes wurde net beynfloede troch dizze en Stipe fan oare gegevens.Dêrom wurdt bygelyks de aktive side fan NiRAN beskôge as de konservearre Asp as in algemiene basis (D252 yn Pseudomonas syringae SelO; D4271 yn HCoV-229E pp1ab; D208 yn SARS-CoV-2 nsp12) (SI Appendix, figuer 2) ).S2) (17, 22, 33), wylst de katalyse yn 'e ATP-ôfhinklike RNA-ligase en RNA-capping-enzyme wurdt útfierd troch it kovalente enzyme-(lysyl-N)-NMP-intermediate, dat omfettet in net-feroare Lys-residu ( 41).Derneist fersette de opmerklike op sesje-basearre spesifisiteit fan it coronavirus NiRAN foar bewarre proteïnedoelen en de ûntspannen spesifisiteit foar NTP-co-substraten (foarkar UTP) tsjin NiRAN-bemiddele kapjenzyme as RNA-ligase-like funksjes.
Fansels is in protte ekstra wurk nedich om de mooglike rol fan nsp9-UMP (nsp9-NMP) te ferifiearjen en, as bewiisd, út te wreidzjen yn protein-induzearre RNA-synteze, dy't ferskate nijsgjirrige mar (oant no ta) rapporten sille ferbine .Isolearre observaasjes.Bygelyks, it is bepaald dat it ein fan 'e negative-string RNA fan coronavirus begjint mei in oligo (U) strand (42, 43).Dizze observaasje is konsistint mei it idee dat de synteze fan negatyf-streng RNA wurdt inisjeare troch it binen fan 'e UMPylearre foarm fan nsp9 oan' e poly(A) sturt (triggers), dy't befoardere wurde kin troch syn RNA-bining De aktiviteit en/of ynteraksje mei in oar RTC-protein.It UMP-diel levere troch nsp9 kin dan brûkt wurde as in "primer" foar nsp7/8/nsp12-bemiddele oligouridylaasje, mei help fan de 3??²-poly(A) sturt yn it genomyske RNA as in oare oligo (A)-befette sesje tsjinnet as sjabloan, fergelykber mei it meganisme fêststeld foar it picornavirus VPg-protein (44).Wat as it foarstel "net-normatyf" is????De inisjatyf fan 'e (proteïne-induzearre) negative-string RNA-synteze jout in keppeling nei de observaasjes, wat oanjout dat it coronavirus negative-string RNA UMP (ynstee fan UTP) oan syn ein hat (42), wat wurdt beskôge om oan te jaan dat de nucleic acid Dicer cleaves it ein phosphorylated troch in ûnbekende uridine-spesifike endonuclease.As befêstige, kin dizze hydrolytyske aktiviteit fan nukleïnesûr helpe om de oligomere UMPylearre foarm fan nsp9 frij te meitsjen fan it 5 ² ein fan 'e opkommende negative strân.De mooglike rol fan nsp9 yn proteïne-priming is ek konsistint mei eardere reverse genetyske stúdzjes, dy't hawwe oantoand dat nsp9 (en nsp8) kritysk en spesifyk ynteraksje mei it bewarre cis-aktearjende RNA-elemint tichtby it 3-ein fan it coronavirus-genoom.45).Neffens dit rapport kinne dizze eardere waarnimmings no op 'e nij ûndersocht en útwreide wurde troch fierder ûndersyk.
Gearfetsjend, ús gegevens bepale de spesifike aktiviteit fan in proprietêre nêste firus enzyme tag keppele oan RdRp oan de N-terminus.Yn coronavirus wurdt dizze nij ûntdutsen NiRAN-bemiddele UMPylator / NMPylator-aktiviteit brûkt om te fertrouwen op Mn2+ en neistlizzende Asn-residuen en de foarming fan (leech-enerzjy) fosforamidaatferbiningen te feroarsaakjen mei it N-terminale primêre amine.Troch Mpro-bemiddele spalting op 'e nsp8 | 9-spaltingsside kin it nsp9-doel brûkt wurde foar NMPylaasje, wat oanjout op de funksjonele keppeling tusken de protease en it NiRAN-domein, dat útwreidet nei RdRp.It behâld fan kaairesiduen yn 'e nsp12 NiRAN aktive side en it nsp9-doel, kombineare mei gegevens krigen fan twa coronaviruses ynklusyf SARS-CoV-2, leveret sterk bewiis dat nsp9 NMPylaasje in coronavirus is. Konservative funksjes binne ek in wichtige stap yn firusreplikaasje.De beskikbere gegevens liede ús om te konkludearjen dat de spesifike rol fan NMPylearre foarm fan nsp9 yn protein-induzearre RNA-synteze in ridlik senario is foar coronavirus en oare nestelde firussen, en NiRAN kin ek rjochtsje op oare unidentifisearre aaiwiten.Regelje it firus.Host ynteraksje.As befêstige, sil de belutsenens fan proteïneprimers yn 'e virale RNA-synteze de sekwinsje-affiniteit fan' e Mpro/3CLpro- en RdRp-domeinen ferheegje tusken it earder ûntdutsen coronavirus en picornavirus-like supergroep (9), dy't no binne ferienige yn 'e koartlyn oprjochte Pisonivirites ( 46) yn de kategory.
Us gegevens litte ek sjen dat de basis, selektive en konservative enzymaktiviteiten identifisearre yn dizze stúdzje kinne wurde brûkt as doelen foar antivirale medisinen.Ferbinings dy't ynterferearje mei de bining (en folgjende modifikaasje) fan 'e bewarre nsp9 N-terminus yn' e aktive side fan NiRAN kinne wurde ûntwikkele ta effektive en alsidige antivirale medisinen, geskikt foar de behanneling fan dierlike en minsklike coronaviruses fan ferskate (sub)genus-ynfeksjes , ynklusyf SARS-CoV-2 en Midden-Easten Respiratory Syndrome Coronavirus.
De kodearring folchoarder fan it coronavirus aaiwyt produsearre yn dizze stúdzje waard fersterke troch RT-PCR mei help fan RNA isolearre út Huh-7 ynfektearre mei HCoV-229E of Vero E6 ynfektearre mei SARS-CoV-2, en ynfoege mei help fan standert cloning prosedueres.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) of pASK3-Ub-CHis6 (47) ekspresje vector (SI taheaksel, tabellen S1 en S2).Single codon substitúsjes waarden yntrodusearre troch PCR-basearre site-rjochte mutagenese (48).Om it MBP-fúzjeprotein te produsearjen, waarden E. coli TB1-sellen omfoarme mei it passende pMAL-c2-plasmidekonstruksje (SI taheakke, Tabel S1).It fúzjeprotein waard suvere troch amylose-affiniteitskromatografy en spjalte mei faktor Xa.Ferfolgens waard it C-terminale His6-tagged proteïne suvere troch Ni-immobilisearre metaalaffiniteitskromatografy (Ni-IMAC) lykas earder beskreaun (49).Om it ubiquitin-fúzjeproteïne te produsearjen, brûkten E. coli TB1-sellen de passende pASK3-Ub-CHis6-plasmidekonstruksje (SI Appendix, Tabellen S1 en S2) en pCGI-plasmide-DNA dy't kodearje foar ubiquitin-spesifike C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Feroaring (47).It C-terminale His6-tagged coronavirusprotein waard suvere lykas earder beskreaun (50).
De sels-NMPylaasjetest fan HCoV-229E nsp12-His6 waard útfierd lykas beskreaun yn EAV nsp9 (16).Koartsein, nsp12-His6 (0.5 µM) befettet 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM, buffer de oantsjutte NTP en 0.17 µM oerienkomme mei [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) by 30 °C foar 30 minuten.Yn alle oare (standert) NMPylaasje-assays fan nsp12-bemiddele nsp9 NMPylaasje wurde de reaksjebetingsten as folget oanpast: nsp12-His6 (0.05 µM) en nsp9-His6 (4 µM) yn 'e oanwêzigens fan 50 mM HEPES-KOH (pH 8. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM oanjûn NTP, en 0.17 µM matched [α32-P]NTP.Nei it ynkubearjen foar 10 minuten by 30 ° C, waard it reaksjemonster mingd mei SDS-PAGE-monsterbuffer: 62.5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol en 0.005% bromophenol blau.It proteïne waard denaturearre troch ferwaarming op 90 ° C foar 5 minuten en skieden troch 12% SDS-PAGE.De gel is fêst en bevlekt mei Coomassie Brilliant Blue-oplossing (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), ûntkleurd, en bleatsteld oan in phosphorescent byldskerm foar 20 oeren (om nsp12 te detektearjen fan NMPylaasje) of (maksimaal) 2 Oeren (om nsp9 NMPylaasje te beoardieljen).In Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) waard brûkt om it skerm te scannen en ImageJ waard brûkt om de sinjaalintensiteit te analysearjen.
Foar MS-analyze waarden 1 µM nsp12-His6 en 10 µM nsp9 (sûnder hexahistidine-tag) brûkt yn NMPylaasje-analyse (SI taheakke, Tabel S1) en de ferhege konsintraasje fan 500 µM UTP en GTP waarden brûkt.Ofhinklik fan har konsintraasje en ferwachte proteïnekwaliteit, waard in Waters ACQUITY H-Klasse HPLC-systeem útrist mei in MassPrep-kolom (Waters) brûkt om 1 oant 10 µL fan bufferde proteïne-oplossingen online te ûntsalten.De desalted proteïne wurdt eluted yn de electrospray ion boarne fan Synapt G2Si massa spektrometer (Waters) troch de folgjende gradient fan buffer A (wetter / 0,05% formic acid) en buffer B (acetonitril / 0,045% formic acid), en de kolom temperatuer is 60 ° C en in trochstreaming fan 0,1 mL / min: eluaasje isokratysk mei 5% A foar 2 minuten, dan in lineêre gradient nei 95% B binnen 8 minuten, en hâld 95% B foar in oare 4 minuten.
Positive ioanen mei in massa berik fan 500 oant 5000 m / z wurde ûntdutsen.Glu-fibrinopeptide B wurdt elke 45 sekonden mjitten foar automatyske massadriftkorreksje.Brûk MassLynx ynstrumint software mei MaxEnt1 útwreiding foar in deconvolve it gemiddelde spektrum nei ôftrek fan de baseline en smoothing.
UMPylated HCoV-229E nsp9 waard digested troch it tafoegjen fan sequencing-grade modified trypsin (Serva) en ynkubeare oernacht by 37 ° C.In Chromabond C18WP spinkolom (dielnûmer 730522; Macherey-Nagel) waard brûkt om de peptiden te ûntsalten en te konsintrearjen.Uteinlik waard it peptide oplost yn 25 µL wetter, dat 5% acetonitril en 0,1% mieresûr befette.
De samples waarden analysearre troch MS mei in Orbitrap Velos Pro massaspektrometer (Thermo Scientific).De ultime nanoâ HPLC systeem (Dionex), útrist mei in oanpaste ein-fêstmakke 50 sm ??75 μm C18 RP kolom fol mei 2,4 μm magnetyske kralen (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Ferbine mei de massaspektrometer online fia de Proxeon nanospray boarne;ynjeksje 6 µL trypsine-digestion-oplossing yn in 300 µm binnendiameter ×??1 sm C18 PepMap pre-konsintraasje kolom (Thermo Scientific).Mei it brûken fan wetter / 0.05% mieresûr as it solvent, waard de stekproef automatysk fongen en desalinearre mei in streamsnelheid fan 6 µL / min.
De folgjende gradiënten fan wetter / 0,05% mieresûr (oplosmiddel A) en 80% acetonitril / 0,045% mieresûr (oplosmiddel B) waarden brûkt om de skieding fan tryptyske peptiden te berikken by in trochstreaming fan 300 nL / min: 4% B foar 5 minuten, dan 30 A lineêre gradient nei 45% B binnen minuten, en in lineêre ferheging nei 95% solvent B binnen 5 minuten.Ferbine de chromatografyske kolom mei in roestfrij stiel nano-emitter (Proxeon), en spuite de eluent direkt oan 'e ferwaarme kapillair fan' e massaspektrometer mei in potinsjeel fan 2.300 V. De enkête scan mei in resolúsje fan 60.000 yn 'e Orbitrap-massaanalysator is assosjearre mei op syn minst trije gegevens MS / MS scans, dynamysk útsletten foar 30 sekonden, mei help fan lineêre ion trap collision induced dissociation of hegere enerzjy botsing dissociation kombinearre mei orbitrap detection, De resolúsje is 7.500.
Post tiid: Aug-03-2021